通過陣列式標(biāo)簽高通量測序高效鑒定點(diǎn)突變單克隆細(xì)胞
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圖2 陣列式標(biāo)簽PCR擴(kuò)增法構(gòu)建rs826415位點(diǎn)打靶的多克隆K562細(xì)胞二代測序文庫
圖1利用CRISPR/Cas9介導(dǎo)的同源重組在K562rs826415位點(diǎn)引入G到T點(diǎn)突變2.5單克隆突變細(xì)胞的篩選鑒定
圖3 二代測序分析篩選陽性率最高的rs826415位點(diǎn)打靶K562細(xì)胞多克隆
CRIPSR/Cas9系統(tǒng)為基因編輯提供了有效的工具,但其介導(dǎo)同源重組獲得精確編輯的點(diǎn)突變細(xì)胞效率仍然偏低,相對早期胚胎和干細(xì)胞來說,體細(xì)胞中的編輯效率更低,常在1%以下[3],因而需要篩選大量細(xì)胞以獲得陽性克隆。篩選過程中由于轉(zhuǎn)染和流式分選等引起細(xì)胞損傷、單細(xì)胞不易增殖及流式分....
圖4 Sanger測序鑒定rs826415位點(diǎn)成功G到T點(diǎn)突變的K562單克隆細(xì)胞株
目前本研究只獲得了雜合型的定點(diǎn)突變克隆,為提高精確基因編輯的純合型細(xì)胞得率可采取添加非同源末端連接(non-homologousendjoining,NHEJ)抑制劑,使用Cas9的不同變體[2]、CRISPR核糖核蛋白[CRISPRribonucleoprotein(R....
圖1 利用CRISPR/Cas9介導(dǎo)的同源重組在K562 rs826415位點(diǎn)引入G到T點(diǎn)突變
陣列式標(biāo)簽PCR擴(kuò)增的混合文庫首先通過Agilent2100Bioanalyzer進(jìn)行質(zhì)量控制檢查,檢測結(jié)果顯示文庫主帶在431bp左右,產(chǎn)物大小合適,沒有小片段污染,說明文庫建庫質(zhì)量合格(圖3A),雙端測序(2×150bp)后分析每孔多克隆細(xì)胞的同源重組率和插入缺失率。....
本文編號:4052086
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