溴氰菊酯因具有良好的生物活性和環(huán)境相容性而被廣泛應(yīng)用于公共衛(wèi)生、獸醫(yī)學(xué)、尤其是農(nóng)業(yè)領(lǐng)域,使其成為全球廣泛使用的擬除蟲菊酯之一,導(dǎo)致了全球性的抗藥性,而且與其它類型的殺蟲劑之間存在廣泛的交互抗性。因此,深入研究溴氰菊酯的抗性機(jī)理具有非常重要的意義。Keap1-Nrf2-ARE通路是目前已知的最重要的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激通路之一。Nrf2轉(zhuǎn)錄因子在活性氧刺激下會與構(gòu)象發(fā)生改變的Keap1蛋白解偶聯(lián),移位至細(xì)胞核內(nèi)集聚并且與抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合,從而激活下游大量抗氧化蛋白與代謝解毒酶。大量研究表明,除活性氧以外,很多外源性有毒物質(zhì)也會刺激機(jī)體內(nèi)該通路的表達(dá)。本課題組的前期實驗發(fā)現(xiàn),溴氰菊酯能明顯提高果蠅Kc細(xì)胞內(nèi)Nrf2基因的表達(dá)水平,并促進(jìn)Nrf2轉(zhuǎn)錄因子向核內(nèi)移位和集聚。本研究在此基礎(chǔ)上,比較了Nrf2和Keap1基因過表達(dá)或被干擾情況下細(xì)胞對溴氰菊酯的耐受水平的影響,以及Nrf2和Keap1基因表達(dá)水平變化對細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響,證實Keap1-Nrf2-ARE通路與溴氰菊酯耐受相關(guān)。主要結(jié)果如下:1)流式細(xì)胞數(shù)據(jù)分析顯示20 ppm的溴氰菊酯處理果蠅Kc細(xì)胞24 h能促進(jìn)細(xì)胞凋亡,Nrf2基...

【文章頁數(shù)】：65 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第1章 緒論
    1.1 昆蟲抗性機(jī)理的研究進(jìn)展
        1.1.1 抗性形成學(xué)說
        1.1.2 抗性機(jī)理研究概述
            1.1.2.1 生理生化抗性
            1.1.2.1 .1 表皮穿透性的降低
            1.1.2.1 .2 解毒代謝作用的增強(qiáng)
            1.1.2.1 .3 敏感度降低
            1.1.2.2 行為抗性
        1.1.3 Keap1-Nrf2-ARE通路
            1.1.3.1 Keap1-Nrf2-ARE通路在昆蟲解毒代謝中的作用
        1.1.4 轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用
        1.1.5 本研究的目的與意義
第2章 Nrf2和Keap1 基因表達(dá)量變化對果蠅Kc細(xì)胞耐受溴氰菊酯應(yīng)激的影響
    2.1 實驗材料
        2.1.1 實驗對象與培養(yǎng)方法
        2.1.2 實驗試劑
        2.1.3 實驗耗材與儀器
    2.2 實驗方法
        2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
        2.2.2 藥物處理
        2.2.3 總RNA的提取與c DNA的合成
            2.2.3.1 傳統(tǒng)TriZol法提取RNA
        2.2.4 過表達(dá)果蠅Kc細(xì)胞內(nèi)Nrf2和Keap1 基因
            2.2.4.1 PIB/V5-Nrf2 載體的構(gòu)建及質(zhì)粒的提取
            2.2.4.2 PIB/V5-Keap1 載體的構(gòu)建及質(zhì)粒的提取
            2.2.4.3 目的基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞
            2.2.4.4 基因水平上轉(zhuǎn)染效率檢測
            2.2.4.5 蛋白水平上轉(zhuǎn)染效率檢測
        2.2.5 干擾果蠅Kc細(xì)胞內(nèi)Nrf2 基因
            2.2.5.3 基因水平上干擾效率檢測
            2.2.5.4 蛋白水平上干擾效率檢測
        2.2.6 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率
    2.3 實驗結(jié)果
        2.3.1 轉(zhuǎn)染Nrf2 基因質(zhì)粒和Keap1 基因質(zhì)粒后基因表達(dá)水平的變化
        2.3.2 轉(zhuǎn)染Nrf2 基因質(zhì)粒和Keap1 基因質(zhì)粒后蛋白表達(dá)水平的變化
        2.3.3 轉(zhuǎn)染Nrf2 基因dsRNA后基因表達(dá)水平的變化
        2.3.4 轉(zhuǎn)染Nrf2 基因dsRNA后蛋白表達(dá)水平的變化
        2.3.5 Nrf2、Keap1 基因表達(dá)量的變化與溴氰菊酯應(yīng)激之間的關(guān)系
    2.4 小結(jié)與討論
第3章 RNA-Seq檢測溴氰菊酯脅迫下果蠅Kc細(xì)胞基因表達(dá)譜的變化
    3.1 實驗材料
        3.1.1 實驗對象與培養(yǎng)方法
        3.1.2 實驗試劑
        3.1.3 實驗耗材與儀器
    3.2 實驗方法
        3.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
        3.2.2 藥物處理
        3.2.3 送測前處理
        3.2.4 轉(zhuǎn)錄組測序
        3.2.5 熒光定量PCR驗證
    3.3 實驗結(jié)果
        3.3.1 轉(zhuǎn)錄組測序篩選所得溴氰菊酯誘導(dǎo)的差異表達(dá)基因
        3.3.2 對差異表達(dá)基因進(jìn)行Gene ontology和 Pathway功能分析
        3.3.3 熒光定量PCR驗證差異表達(dá)基因
    3.4 小結(jié)與討論
第4章 Nrf2、Keap1 基因表達(dá)量變化對果蠅Kc細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響
    4.1 實驗材料
        4.1.1 實驗對象與培養(yǎng)方法
        4.1.2 實驗試劑
        4.1.3 實驗耗材與儀器
    4.2 實驗方法
        4.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
        4.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與藥物處理
        4.2.3 送測前處理
        4.2.4 轉(zhuǎn)錄組測序
        4.2.5 熒光定量PCR驗證
    4.3 實驗結(jié)果
        4.3.1 轉(zhuǎn)錄組測序分析過表達(dá)Nrf2的Kc細(xì)胞基因表達(dá)譜
        4.3.2 轉(zhuǎn)錄組測序分析低表達(dá)Nrf2 或過表達(dá)Keap1 與溴氰菊酯應(yīng)激之間的關(guān)系
        4.3.3 熒光定量PCR驗證轉(zhuǎn)錄組測序準(zhǔn)確性
    4.4 小結(jié)與討論
全文總結(jié)
參考文獻(xiàn)
在讀學(xué)位期間的研究成果
致謝



本文編號：4052508